摘 要：对不同方法学的检测项目收集一定数量的标本进行56℃30分钟热灭活研究，通过灭活前后数据差异比较分析，明确哪些项目不受热灭活的影响；哪些项目结果影响较大但数据存在相关性，用回归方程校正后检测数据仍具有参考价值；哪些项目统计学差异较大无法校正，需要寻找其他更合适的灭活方法或者替代检测指标。
　　关键词：新型冠状病毒；热灭活；常用检验项目
　　新型冠状病毒（SARS-CoV-2）传染力强，人群普遍易感，其引起的新型冠状病毒肺炎（COVID-19）目前我的尚无针对特异性治疗药物。国家卫生健康委员会将其纳入乙类传染病，并按甲类传染病进行预防和控制［1］。由于COVID-19患者血液、体液标本具有潜在传染性，实验室检测人员存在职业暴露可能，给实验室检测人员带来极大的心理压力和较高的院感防控风险［2］。《新型冠状病毒肺炎防控方案》各个版本均指出SARS-CoV-2在56℃30min处理可被灭活［3］，但灭活后哪些项目不受影响，哪些项目可以参考使用，哪些项目坚决不可以灭活尚不清楚。本研究将探讨56℃30min灭活处理对实验室常用检测指标结果的影响，为降低实验室院感风险和保护实验室检测人员安全，为临床提供一份可靠的检验报告提供参考。
　　研究方法：
　　临床资料收集
　　收集2020年1月-12月在汉中市中心医院就诊的门诊及住院患者的生化标本40例，传染病八项40例，新冠抗体标本55例，肿瘤标志物40例、甲状腺功能标本40例，自身免疫性抗体ANA40例，ANCA标本30例，涵盖不同的年龄段。
　　仪器与试剂
　　生化项目检测采用日立7180全自动生化分析仪及配套试剂检测，
　　发光项目中传染病8项、肿瘤标志物及甲状腺激素项目使用德国罗氏有限公司电化学发光设备（Cobas e801）及厂家配套试剂，新冠抗体项目检测使用重庆博奥赛斯公司磁微粒化学发光法设备（Axceed 260）。荧光免疫指标中抗核抗体（ANA）、抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）使用欧蒙公司的间接荧光免疫手工加样检测，结果由奥林巴斯荧光显微镜进行人工读取。脱帽离心机型号LXJ-IIC（上海安亭科学仪器厂）、恒温水浴箱型号HH-S6（山东博科科学仪器有限公司）。
　　标本处理与检测：
　　采用负压真空采血管（黄帽管）采集血液标本5mL，分装成两管，其中一管室温放置，另一管放入56℃水浴箱进行灭活处理，30min后同时进行1500g离心10min，再在相应检测设备上进行相同指标检测。
　　统计分析：
　　使用SPSS20.0软件进行统计学分析，不符合正态分布的计量资料采用M（P25，P75）表示，组间比较采用自身配对样本非参数检验（Wilcoxon符号秩和检验）。P<0.05为差异有统计学意义，须对灭活前后的数据进行直线相关和回归分析，得到回归方程和相关系数，以便于校正后消除影响参考使用。计数资料用例数表示，灭活前后的一致性用符合率和Kappa值表示。Kappa值＞0.75，为一致性好；Kappa值0.40-0.75，为一致性一般；Kappa值＜0.40，为一致性较差。
　　结果与分析：
　　灭活处理前后血清常规生化结果
　　常规生化检测发现灭活处理前后肝功能中的丙氨酸氨基转移酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP），肾功中二氧化碳总量（TCO2）结果在灭活处理前后差异有统计学意义（P<0.05），心肌酶检测中的肌酸激酶（CK）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）水平在灭活处理前后差异有统计学意义（P<0.05），其余项目灭活处理前后差异无统计学意义（P≥0.05）。对有差异的项目进行直线回归分析，ALT、ALP、CKMB均可以进行校正后参考使用，而TCO2、CK不具有相关性，无法进行校正。
　　灭活处理前后血清发光检测项目结果
　　传染病八项（HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBe-Ab、HBcAb、HCV-Ab、HIV-Ab和TP-Ab）差异无统计学意义（P>0.05）。常用肿瘤标志物检测中CYFRA21-1检测具有统计学意义（P<0.05），其他项目AFP、CEA、CA724、CA125、CA153、NSE、HE4、BNP、HCG、CA199、PTH检测结果在灭活处理前后差异无统计学意义（P≥0.05）。
　　甲状腺激素中T3、T4均不同程度的受到热灭活的影响，结果差异有统计学意义（P<0.05），而TSH、FT3、FT4、ATG、A-TPO灭活前后差异无统计学意义（P≥0.05）。
　　SARS-CoV-2IgM和IgG灭活前后差异无统计学意义（P>0.05），SARS-CoV-2IgM抗体和IgG抗体检测结果阴阳性符合率均为100%，
　　灭活处理前后ANA和ANCA结果
　　30例ANA阳性标本中，11例核颗粒阳性、10例为核均质、5例胞浆颗粒型，2例核点型标本，2例核仁型标本；30例ANCA中，20例pANCA、10例c-ANCA，加热灭活处理后的核型未发生改变，荧光强度也未发生变化。阴阳性标本在灭活处理前后符合率为100％，Kappa值=1＞0.75，一致性好。
　　讨论
　　2019年末暴发的新型冠状病毒肺炎疫情严重威胁世界公共卫生安全，目前SARS-CoV-2已成为全球大流行［4］。新冠病毒易于在人群中传播，已确证医学实验室人员在接触患者血液、尿液、粪便等样本时可产生气溶胶，造成检验等医务人员的感染［5］。在病毒感染患者诊断、鉴别诊断及治疗过程中须要监测肝、肾、心功能等生化指标、传染病、肿瘤标志物、新冠抗体等检验指标。如果不作任何处理即对相关标本进行检测，极易因职业暴露增加医护工作者感染风险［6］。做好生物安全防护外，在不影响检测结果的前提下，若能在检测前将样本进行灭活处理，将大大降低感染的几率。因此，本研究通过比较检验项目灭活前与灭活处理后的结果差异，探讨56℃30min灭活处理对不同检测项目结果的影响，为院感防控提供的一定依据。
　　生化检测项目是疾病监测的最常规的基础指标，是新冠诊疗方案中明确提出的监测指标。本研究发现大部分生化指标在灭活前后差异无统计学意义（P>0.05），而ALT、ALP、TCO2、CK、CKMB5指标在灭活前后差异具有统计学意义（P<0.05），在灭活处理后5个指标都呈现显著的下降。此结论跟刘长德等［7］的研究结果是完全一致的，但不同的是他的研究认为GGT在灭活前后是具有显著变化的。郭旺源等［8］也认为GGT呈现显著性下降的，且LDH也是呈现显著性下降的。但张耀辉等［9］研究显示GGT血清灭活前后差异无显著性（P>0.05），LDH灭活前后差异有高度显著性。ALT、ALP，CK、CKMB均为不耐热酶，56℃加热30min影响了酶的活性，但对于GGT、LDH同属于酶类，其耐热的稳定性，尤其是56℃加热30min处理下的稳定性还存在一定的争议，还需要更大数据的支持。TCO2受灭活影响显著是因为加热使得血清中的二氧化碳丢失所致，同时与标本采集、运输及上机时间有很大关系，与刘长德等［7］的研究结果是一致的。所以该类项目尽量避免热灭活处理或者对结果进行校正后参考使用。
　　特别提出的是hsCRP的检测，在许多研究［7，8，9］中都显示灭活前后差异变化不显著，本实验中生化乳胶凝集法检测也得到了同样的结论。但是近年来随着hsCRP在炎性指标中的作用不断受重视，存在多种检测方法学，也存在多种标本检测类型，如本实验室使用散射比浊法。对EDTA-K2抗凝全血标本进行快速检测，而该方法学灭活处理后产生结果差异具有统计学意义（P=0.018，P<0.05）。推测是因为全血标本的热灭活导致红细胞溶解，血红蛋白释出增加，影响到检测结果，导致灭活后显著降低。故在疫情期间建议临床对疑似新冠感染病人使用生化检测替代全血方法的检测，以方便灭活处理，保证检测质量同时降低院感防控风险。
　　发光检测项目中传染病8项灭活后与灭活前结果差异无统计学意义（P>0.05），与郭旺源等［8］、佘宇奇等［10］团队的研究结果相一致。在疫情期间，疑似或确诊2019-nCoV感染患者在各项手术前、侵入性操作前、输血前均需要进行传染性8项的检测，以排除潜在感染。在标本采集之后建议直接将标本放置56℃热灭活30min，然后进行后续标本运输和实验室检测，能够在病毒被灭活前最大程度减少医务工作人员的职业暴露，减少医源性感染的发生。
　　肿瘤标志物11项检测指标在56℃30min灭活处理前后差异无统计学意义（P>0.05），而CYFRA21-1检测具有统计学意义（P=0.012，P≤0.05），这与毕东明等［11］的研究结果是一致的，CYFRA21-1是细胞角蛋白的19片段，是一种可溶性酸性多肽，相对分子质量约为30kD，常常释放到癌症患者血清中被检测出，主要出现在肺部，为非小细胞肺癌的首选生物标志物。推测由于高温变性导致蛋白或蛋白结合位点变性，使结果有显著差异。
　　甲状腺激素研究中显示T3、T4均不同程度的受到热灭活的影响，而其他5项灭活前后差异无统计学意义。与毕东明等［11］的报告是不一致的，他的研究认为此7项在56℃30min热灭活前后是不受影响的。而本研究显示灭活对T3、T4的抗原抗体结合位点、蛋白质活性或免疫原性产生一定的影响，导致差异具有显著性。因目前研究数据尚小，还需要多中心大数据研究来进一步证实。
　　SARS-CoV-2 IgM和IgG抗体研究结果显示两抗体灭活前后差异无统计学意义（P>0.05），抗体结果阴阳性符合率为100%。与郭旺源等［7］的研究灭活前后SARS-CoV-2 IgM结果一致性达94.4%有出入。分析其原因是方法学的不同导致的，其抗体检测采用胶体金方法，胶体金方法更容易收到热灭活的影响。薛雄燕等［12］的研究也支持新冠抗体检测方法学的不同导致灭活处理前后符合率不同，免疫层析法灭活前后血清样本中SARS-CoV-2总抗体的阴性符合率为100%，阳性符合率为90.9%，总符合率均为95.2％。荧光免疫层析法检测灭活前后阳性符合率100%，阴性符合率0%，总符合率均为47.6％。化学发光免疫分析法检测灭活前后阴阳符合率及总符合率均为100％，与本研究研究结果相一致。所以在进行标本热灭活处理前除了关注项目本身、标本类型，还需要关注同一个项目的检测方法学。
　　荧光免疫ANA和ANCA的检测，疫情期间多用于对基础性疾病的诊断和新冠病人与自身免疫性疾病、肺肾出血等并发症的鉴别诊断。本研究结果显示ANA及ANCA阴阳性符合率，不同滴度、不同核型阴阳性符合率灭活前后不受影响。目前资料较少，尚未查到此方面灭活前后结果的研究报道。
　　结论
　　56℃30min热灭活可以对检验科常用项目进行处理，生化类指标除自身不稳定项目TCO2、少量不耐热的酶类ALT、ALP、CK、CKMB受影响较大，GGT、LDH还需要进一步大数据验证其项目是否受到影响。发光类指标中传染病8项、肿瘤标志物12项、甲状腺激素5项、新冠抗体2项均不受热灭活影响，可以进行灭活处理；CYFRA21-1受热灭活影响，不可以灭活处理；T3、T4项目还需要进一步大数据验证其是否受热灭活的影响。荧光免疫ANA和ANCA灭活前后核型和荧光强度一致性为100%，可以进行灭活处理。hsCRP灭活影响跟实验室具体检测方法学、标本类型及检测试剂有关。疫情期间建议对疑似新冠感染病人开展不受影响的检测方法学，在标本流上游即对不受影响的项目标本进行56℃30min热灭活处理，以保证检测结果质量，同时降低院感防控风险。
　　本次初步研究完全模拟日常检测流程，检测过程中的随机误差因素未得到更为有效的控制。由于实验室条件限制，对56℃30min热灭活处理后的病毒灭活效率无法进行验证，因此其降低实验室检测生物安全压力的程度尚不能完全评估。
　　参考文献
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　　本文主要作者介绍：
　　第一作者：陈文华（1979-），女，陕西省汉中市中心医院检验科副主任检验技师，硕士研究生，主要从事临床血液学检测与研究。
　　通讯作者：毋崇岭（1979-），陕西省汉中市中心医院脊柱外科副主任医师，硕士研究生，主要从事脊柱退行性病变的诊疗。
　　陕西省提升公众科学素质计划项目【编号：2020PSL（Y）010】